厉害!浙大、中科大Nature+1,湖北大学首次以通讯单位发Nature

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本文来源:高分子科学前沿

01、浙大Nature+1,今年第23篇CNS!

湖北大学首次以通讯单位发Nature!

拟南芥生长素转运蛋白PIN3的结构和机制

在植物的生长过程中,PINs(生长素外流载体)是PAT(极性生长素转运)系统的主要组成部分,其功能主要是控制生长素从细胞膜向细胞外空间的输出和通过其精细调节的极性膜定位控制生长素在组织中的分布。近60年来,萘基邻苯二甲酸(NPA)一直被用作研究PAT机制的生长素转运的抑制剂, 但是关于NPA是否以及如何抑制PINs的吲哚-3-乙酸(IAA)运输行为仍然无法解释,PINs的分子机制仍有待深入研究。

近期浙江大学郭江涛副教授、杨帆研究员联合湖北大学吴姗教授以2.6-3.0埃的分辨率展示了拟南芥PIN3(AtPIN3)在apo状态下以及与其底物IAA和抑制剂NPA复合时的冷冻电镜结构。通过结构和功能的分析,加以辅助计算研究,揭示了识别IAA和NPA的结构基础,并阐明了NPA对PIN介导的辅助素运输的分子抑制机制。AtPIN3的结构支持一个类似电梯的生长素运输模型,其中运输域进行上下的刚体运动,而二聚体支架域保持静止。相关实验成果以“Structures and mechanisms of the Arabidopsis auxin transporter PIN3”为题发表在Nature上。

AtPIN3的功能与结构

为了表征AtPIN3的活性,作者建立了体外放射性IAA 转运试验。首先证实了AtPIN3可以运输输 IAA。然后通过加入抑制剂NPA,观察到有NPA效抑制了IAA的流出,从而证实了这种 IAA流出是由AtPIN3 控制的。接着作者测定了AtPIN3apo、AtPIN3IAA 和AtPIN3 NPA三种结构,并发现他们结构类似。AtPIN3以同源二聚体的形式存在,具有垂直于膜的C2对称性。在每个亚单位中,AtPIN3包含10个跨膜螺旋(TM1-10),其N端和C端都位于细胞外侧。TM1-5和TM6-10是倒置的结构重复,由平行于膜平面的伪二重对称轴联系在一起,产生的RMSD为3.5 Å。

图1:AtPIN3的整体结构

NPA的抑制机理

因为这两种化合物在AtPIN3中具有相似的结合模式,所以NPA可以占据 AtPIN3中的IAA 结合位点,。NPA和IAA的重叠解释了NPA对AtPIN的抑制作用。在NPA中,大萘基一方面加强了其与 AtPIN3疏水相互作用,另一方面,阻止它被AtPIN3在潜在的底物运输。因此NPA通过直接在IAA结合位点结合,以较高的亲和力抑制AtPIN3的IAA转运活性。

AtPIN3的二聚体组装

AtPIN3的二聚化主要归因于TM1-2和TM7之间的对称相互作用。在两个亚基的支架结构域中的对称相互作用,其相互作用的表面积为1516 Å2。此外,TM1-2和TM7二聚体作为一个整体的支架,将一个运输结构域悬挂在运输体的两侧。在转运体二聚体的每一侧悬挂一个转运域。此外,两个TM7在Gly532处弯曲约30°,在二聚体接口处形成一个面向细胞外的约120°角,其顶点大约在膜的一半处。在二聚体界面一侧的每个面向细胞外的空腔侧面没有跨膜螺旋,这使得两个面向细胞外的空腔在二聚体界面结合成一个大的碗状面向细胞外的空腔,这个大的空腔为辅助素从两个亚基释放到细胞外提供了足够的空间。

图AtPIN3的二聚化和提出的模型


02、中科大Nature+1,今年第7篇正刊

拟南芥AtPIN1的结构及其底物识别和NPA抑制机制

辅酶在调节植物生长和发育的几乎每一个方面都起着关键作用。辅酶的一个突出特点是其细胞间的定向运输,即极性辅酶运输(PAT),使植物能够协调发育和适应外源信号。这一过程的关键成分,PIN辅酶输出体,已受到广泛关注,因为它们的极性亚细胞定位决定了PAT的方向性,在不对称的辅酶分布和植物发育中发挥关键作用。在拟南芥中,PIN1至PIN8共享两个保守的氨基(N)端和羧基(C)端结构域,由一个不太保守的亲水环(HL)连接。短PINs通常在内质网,而长PINs在质膜上,并通过内吞和回收进行动态调节。突出的辅助素出口和PAT抑制剂已被广泛使用,并有助于建立辅助素外流在PAT中的关键作用。然而,它们的结构和运输机制在很大程度上仍然是未知的。NPA直接针对PINs,但其作用机制仍然未知。拟南芥的PIN1和PIN2/EIR1是最早发现的PINs。AtPIN1是主要成员,在胚胎、顶端分生组织和血管组织以及发育中的器官中发挥关键作用。PIN1的缺乏导致裸露的针状花序。

在这项研究中,中国科大的Liu Xin 与孙林峰教授着手确定AtPIN1的结构并揭示其底物识别和NPA的抑制机制。作者报告了PIN家族的主要成员,拟南芥的PIN1(AtPIN1)的三种内向构象结构。(i)apo状态,(ii)天然辅酶、吲哚-3-乙酸(IAA)结合状态,以及(iii)与PAT抑制剂N-1-萘酞酸(NPA)的复合状态。AtPIN1的跨膜结构域有一个保守的NhaA褶皱。在底物结合结构中,IAA通过疏水堆积和氢键协调。抑制剂NPA以更高的亲和力与IAA竞争细胞内口袋的同一位置。这些发现促进了作者对PINs的底物识别和运输机制的理解,并为未来对辅助素的定向移动的研究建立了一个框架,这是植物发育的最关键过程之一。相关工作以题为“Structural insights into auxin recognition and efflux by Arabidopsis PIN1”发表在最新一期《Nature》上。

其中,不得不提的是,据统计中科大今年已经发表了4篇《Science》,3篇《Nature》。

文章要点

作者对PIN生长素出口商的主要和创始成员AtPIN1的结构和底物结合谱进行了描述。目前已经提出了一种类似电梯的交替访问机制描述具有特征的NhaA-fold转运体,该机制基于可用的朝外和朝内结构,并伴随着几个示例的功能分析。虽然该模型也适用于基于AtPIN1的IAA传输,但其确认需要在传输周期中捕获更多状态,特别是向外的结构。NPA和IAA直接竞争AtPIN1的细胞内结合口袋。由于NPA和AtPIN1之间的亲和力较高,一旦NPA结合,即使在较高浓度下也禁止IAA进入。

一个有趣的问题是关于AtPIN1介导的生长素转运的能源。由于IAA作为弱酸的化学性质,质子化或去质子化形式的比例在不同的pH值下有所不同。在生长素转运的化学渗透假说中,质外体中质子化的疏水性IAAH很容易通过脂质双层扩散。一旦进入中性或碱性细胞内pH环境,它主要以去质子化的IAA形式存在,并且由转运蛋白(如PIN)辅助的输出是必不可少的。作者的体内测定结果支持该模型,表明没有AtPIN1表达,几乎没有IAA流出发生。假定PM处相同的pH梯度是生长素输出的能源。然而,作者没有检测到pH5.5和6.5之间的相对IAA保留有任何显着差异。同样,作者没有检测到pH值对IAA与AtPIN1结合的太大影响。这两项发现都表明PIN传输可能不利用pH梯度。尽管如此,这需要进一步验证,优先使用清洁的体外运输系统。

总之,作者的研究为生长素流出和PAT机制提供了期待已久的结构见解。他们为未来基于结构的PIN功能分析和农业用生长素类似物的设计建立了一个框架。

Figure 1. 在HEK293F细胞中AtPIN1介导的辅酶运输的特征和二聚体AtPIN1的低温电镜结构。

Figure 2. IAA和NPA在AtPIN1的细胞内袋中相互协调

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